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标准化

从数据会集删去不需要的细胞后，下一步是数据标准化。默许情况下，咱们采用大局缩放标准化办法“LogNormalize”，该办法将每个单元格的特征表达测量值标准化为总表达，将其乘以份额因子（默许为 10,000），并对结果进行对数转化。在 Seurat v5 中，标准化值存储在 pbmc[[“RNA”]]$data 中。

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

为了清楚起见，在前面的代码行中，咱们为函数调用中的某些参数提供了默许值。

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

尽管这种标准化办法是标准办法并广泛用于 scRNA-seq 剖析，但大局缩放依赖于每个细胞开始包含相同数量的 RNA 分子的假定。咱们和其他人现已为单细胞预处理开发了代替作业流程，但不做出这些假定。关于感兴趣的用户，请检查 SCTransform() 标准化作业流程，论文中描述了该办法。

特征选择：识别高度可变的特征

接下来，咱们计算数据会集表现出高细胞间差异的特征子集（即它们在某些细胞中高度表达，而在其他细胞中表达较低）。在下流剖析中重视这些基因有助于杰出单细胞数据会集的生物信号。

默许情况下Seurat每个数据集返回 2,000 个特征。这些将用于下流剖析，例如 PCA。

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
# Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1   plot2

单细胞Seurat - 数据处理 (2)

缩放数据

接下来，咱们运用线性变换（“缩放”），这是 PCA 等降维技能之前的标准预处理过程。 ScaleData() 函数：

  • 改动每个基因的表达值，使细胞间的平均表达为 0
  • 缩放每个基因的表达，使细胞间的方差为 1
    • 此过程在下流剖析中给予平等的权重，因此高表达的基因不会占主导地位
  • 结果存储在 pbmc[[“RNA”]]$scale.data 中
  • 默许情况下，仅缩放可变特征。
  • 您可以指定 features 参数来缩放附加功用
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
  • 如何消除不需要的变异源

在 Seurat 中，运用 ScaleData() 函数从单细胞数据会集删去不需要的变异源。例如，咱们可以“回归”与细胞周期阶段或线粒体污染相关的异质性，即：

pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")

但是，特别是关于想要运用此功用的高级用户，咱们强烈建议运用新的规范化作业流程 SCTransform()。与 ScaleData() 相同，函数 SCTransform() 也包含 vars.to.regress 参数。

线性降维

接下来咱们对缩放后的数据履行 PCA。默许情况下，仅将从前确认的可变特征用作输入，但如果您期望选择不同的子集，则可以运用 features 参数进行界说（如果您的确想运用自界说的特征子集，请确保首要将它们传递给 ScaleData ）。

关于第一个主成分，Seurat 输出具有最大正负载荷的基因列表，代表在数据会集的单细胞之间表现出相关（或反相关）的基因模块。

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

Seurat 提供了几种有用的办法来可视化界说 PCA 的单元格和特征，包含 VizDimReduction()、DimPlot() 和 DimHeatmap()

# Examine and visualize PCA results a few different ways
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
## PC_ 1 
## Positive:  CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL 
## Negative:  MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2 
## PC_ 2 
## Positive:  CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1 
## Negative:  NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA 
## PC_ 3 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 
## Negative:  PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 
## PC_ 4 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1 
## Negative:  VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8 
## PC_ 5 
## Positive:  GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY 
## Negative:  LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

单细胞Seurat - 数据处理 (2)

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")   NoLegend()

单细胞Seurat - 数据处理 (2)

特别是 DimHeatmap() 答应轻松探究数据会集异质性的主要来历，并且在测验决议包含哪些 PC 进行进一步的下流剖析时非常有用。细胞和特征均根据其 PCA 分数进行排序。将细胞设置为数字会在频谱两端绘制“极点”细胞，这会明显加快大型数据集的绘图速度。尽管是一种监督剖析，但咱们发现这是探究相关特征集的宝贵工具。

DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)

单细胞Seurat - 数据处理 (2)

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)

单细胞Seurat - 数据处理 (2)

单细胞Seurat - 数据处理 (2)

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